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細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)的方法、步驟有哪些?

更新時(shí)間:2023-09-04點(diǎn)擊次數(shù):1465

細(xì)胞免疫熒光主要應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)抗原抗體檢測(cè),適用于細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)。那么細(xì)胞免疫熒光有哪些方法和步驟呢?讓我們一起來看看吧!

一、直接法

將標(biāo)記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標(biāo)本上,經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色,用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢。

二、間接法(較為常用)

如檢查未知抗原,先用已知未標(biāo)記的特異抗體(第一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),用水洗去未反應(yīng)的抗體,再用標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng),使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標(biāo)本是已知的,待檢血清為第一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。

三、操作步驟

1.倒出培養(yǎng)液。

2.潤(rùn)洗,將1ml SDwan全培養(yǎng)基沿培養(yǎng)板緩慢打入,蓋上蓋子,輕柔搖晃,先使用1ml的槍沿側(cè)壁吸出潤(rùn)洗后,再使用200ul的槍沿壁吸出殘液。

3.吹打,加入2ml SDwan全培養(yǎng)基,打在培養(yǎng)板底部,然后反復(fù)抽打,直至培養(yǎng)板底部由磨玻璃樣變?yōu)橥该鳌#ù荡蛑蠓胖?,后使用之前都要反?fù)吹打)

4.將細(xì)胞爬片放入24孔板,每孔一個(gè)(注意每個(gè)孔只放一個(gè),不要多放,注意檢查)。

5.往(3)中吹打后的細(xì)胞液中繼續(xù)加4ml的SDwan全培養(yǎng)基(即總計(jì)6ml)。將細(xì)胞液分裝到24孔板中(分裝之前吹打,防止細(xì)胞沉降而造成的不均勻),每個(gè)板500ul。注意事項(xiàng):每一步打開細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),防止細(xì)胞培養(yǎng)板蓋時(shí)勿使細(xì)胞培養(yǎng)板蓋朝上放置。

6.在將細(xì)胞培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱之前,請(qǐng)噴酒精。

7.細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)之內(nèi)使用,最好20小時(shí)。沿側(cè)壁吸出培養(yǎng)液。1PBS潤(rùn)洗2次,沿側(cè)壁打入1ml或500ul PBS,輕柔搖勻2-3次后,沿側(cè)壁吸出。

8.Pfu number/細(xì)胞數(shù)=pfuV/細(xì)胞數(shù)=感染復(fù)數(shù) 感染復(fù)數(shù)為2,加病毒20ul + 480ul SD培養(yǎng)液 感染復(fù)數(shù)為15,加病毒150ul + 480ul SD培養(yǎng)液 病毒滴數(shù)經(jīng)提前測(cè)定為1*10-7pfu/ml

9.先加SD培養(yǎng)基再加病毒。(24h或48h之后進(jìn)行(10))

10固定細(xì)胞:吸出上清,加4%PFA(組織固定液),1ml/孔,室溫下30min。

11.PBS洗2次,5min/次,1ml/孔。

12.細(xì)胞破膜:0.1% Triton in PBS(PBST,T為Triton) ,PBS:Triton=1L:1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔,室溫1h。

13.封閉:5% BSA in PBST(T:0.5%Tween)=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween)  BSA 為牛血清白蛋白。1ml/孔,室溫下2h。

14.一抗:用封閉液按1:100(比例依照抗體說明書)稀釋,300ul/孔,4攝氏度過夜。

15.PBST(Tween)洗3次,10min/次 。

16.二抗(4℃抗體熒光抗體):用PBST(Tween)按1:1000稀釋,300ul/孔,室溫避光1h。

17.PBST(Tween)洗3次,1ml/孔,10min/次。(18) DPAI ,300ul/孔,室溫避光10分鐘。

18.PBS 洗2次,1ml/孔,立馬抽出。

19.載玻片上滴加封片液,細(xì)胞爬片的細(xì)胞層與封片液接觸。

20.熒光共聚焦顯微鏡觀察。

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