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DNA質(zhì)粒提取的原理是什么?

更新時間:2023-09-14點(diǎn)擊次數(shù):1985

在沒有質(zhì)粒提取試劑盒之前,大多提取質(zhì)粒都是自己配置試劑來提取大腸桿菌中的質(zhì)?!,F(xiàn)在的試劑盒只是改了一個名字而已,試劑還是那幾個試劑。用的原理還是那個原理:堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒,是從事分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室每天都要用的常規(guī)技術(shù)。那么你知道DNA質(zhì)粒提取的原理是什么嗎?讓我們一起來看看吧!

一、為什么用無水乙醇沉淀DNA?

用無水乙醇沉淀DNA,這是實(shí)驗(yàn)中常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶,乙醇不與核酸起任何化學(xué)反應(yīng),對DNA很安全,因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在,當(dāng)加入乙醇時,乙醇會奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易亍聚合。一般實(shí)驗(yàn)中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇(因?yàn)闊o水乙醇的價格比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時,就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙醇,最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。

二、在用乙醇沉淀DNA時,為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1~0.25mol/L?

在pH為8左右的溶液中,DNA分子是帶負(fù)電荷的,加一定濃度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,易互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時,只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合,這樣就造成DNA沉淀不wan全,當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于過多的鹽雜質(zhì)存在,影響DNA的酶切等反應(yīng),必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。

三、加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再要用SDS與KAc來處理?

加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì),為了純化DNA,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀,再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)發(fā)為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,使沉淀更加wan全。也可用飽和酚、氯仺抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到較好效果。

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